贴壁细胞参考:
一. 收货后消毒静置待细胞全部稳定后拍照。弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
二. T25瓶加入0.25%EDTA胰蛋白酶1-2ml于培养瓶中震荡混匀,如果属于贴壁不牢固的细胞很容易脱落的就培养箱外面消化震荡等脱落90%以上终止消化,一般小于1分钟以内,甚至不加胰酶有部分贴壁非常不牢固的细胞也会自然震荡脱落。如果是贴壁牢固的细胞则置于37℃培养箱中消化提高效率,每40-50秒拿出培养箱震荡帮助细胞脱落,如果脱落90%以上则对应3-6ml含有10%血清的完全培养基终止彻底,以防胰酶残留。如果贴壁非常牢固的细胞,脱落的比例比较低,也不超过2分钟后终止消化彻底,再加入1ml完全培养基让细胞缓冲后再过2分钟进行二次消化,反复分步消化以降低单次消化时长,减少刺激,保护细胞膜。或采用刮产刮细胞的方式处理也可以。总归原则是达到消化目的的同时减少细胞膜受到的损伤越小越好。
三.消化完成后轻轻吹匀后吸出,在1000RPM条件下离心3-5min,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1:2的比例分到新T25瓶/6cm培养皿中,添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力,后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。期间多的细胞一定保存多份细胞冻存管备种。