贴壁细胞复苏、传代、冻存及注意事项
一、接收注意事项:
贴壁细胞经过快递运输颠簸会出现漂浮脱落等情况， 收到先放培养箱静置稳定。如有脱落需收集处理，处理细节请查阅以下文件，原瓶内为运输培养液，血清含量只有5%，需及时更换专用完全培养基。
二、传代步骤：
准备工作：胰酶和完全培养基（需要提前37度复温）、PBS（常温）避免细胞遇冷受刺激
（1） 吸出原培养液
（2） 加入2ml左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸出PBS丢弃
（3） 加入1ml左右0.25%含EDTA的胰酶，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞。
（4） 根据不同的细胞放入培养箱时及时关注消化时间，消化约2-3min，显微镜下看到细胞中间的细胞明显分离变圆细胞间隙变大，显微镜下看细胞呈单个游离状态，侧立培养瓶细胞可以滑落时可终止消化，可以轻拍培养瓶侧身。（消化时主要看消化状态，如果没有变圆，侧立时不能滑落时，可以适当延长消化时间，每30s观察一次细胞）
（5） 加入3ml含10%血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使之脱壁并在液体里反复轻轻吹打（不要太用力）使细胞尽量呈单颗细胞的悬浮液。
（6） 收集细胞悬液离心，1000rpm/min（约250g） 5分钟，离心完吸出上清丢弃。
（7） 加入新鲜完全培养基，吹打几下混匀细胞即可，按需接种到新培养瓶，补足完全培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养。
（8） 检查培养箱二氧化碳，温度和水盘。
三、后续处理建议：
传代后2-3天换液一次即可，（如细胞第二天全部贴壁培养基颜色变黄，可以换液，）无需每天换液（换液太勤可能会损失细胞影响细胞状态）换液时候如果没有特殊情况也可以不用PBS清洗。
四、贴壁细胞冻存：
1）镜下观察细胞密度达到80-90%即可冻存，一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml;
2）前半部分和传代方式一样，细胞消化离心后去掉上清。用1ml配制好的冻存液重悬细胞
3）将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息
4）如使用的是无血清冻存液可直接放-80℃冰箱过夜后续可转入液氮罐中长期保存。
如使用的是程序冻存液，需要梯度降温法进行处理。
