HAKATA NK扩增试剂盒(含培养基)说明书

规格：2L体系

货号：HNK-CELLS plus

品牌：HAKATA

厂家：上海慧颖生物科技有限公司

【温馨提示】

为了能获得稳定可靠的结果，请严格按照以下所述步骤进行操作，并使用我们推荐的实验耗材及试剂。本试剂盒包含四种刺激组分(NK Cell Grower1~4)，每管体积为1ml，建议每管组分拿出静置后再加入到培养基中，并用培养基润洗管子，以确保每管所有组分都能加入到培养基中。请认真阅读说明书配置每种扩增液！

【实验材料】

NK Cell Culture Medium(1000 ml) X 2

NK Cell Grower 1(1 ml)  NK Cell Grower 2(1 ml)  

NK Cell Grower 3(1 ml)  NK Cell Grower 4(1 ml)

悬浮细胞专用细胞培养瓶(T75、T175)(透气盖培养瓶，推荐康宁品牌)

悬浮细胞专用培养袋

淋巴细胞分离液

无菌生理盐水或PBS

【实验操作方案】

* 所有的工作必须在无菌室中进行，请严格遵守无菌操作规范，使用无菌耗材。

1、培养瓶包被

(1)  在T-75 cm² 悬浮培养瓶中，加入8 ml PBS 和1ml NK Cell Grower 1；

(2)  轻轻摇晃，使溶液在培养瓶瓶底扩散，铺满瓶底；

(3)  37℃培养箱静置2 h 或在4℃静置过夜；

(4)  移除包被溶液，用15 ml PBS 润洗瓶底1 次(请勿吹打瓶底)，洗过的培养瓶要立即使用。

2、血液分离

(1) 采集40 ml外周血于抗凝管(务必用肝素抗凝管)，800g，15 min室温离心；

(2) 自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中56℃，灭活30 min后 1100g，15 min室温离心，用移液管将上清转移至新的15ml管内，4℃保存备用；

（3）取上述离心后下部细胞成分，加PBS至40 ml，混匀，加到2个装有2ml医疗级人淋巴细胞分离液的5ml离心管中，室温下， 500g 离心30 min，慢升慢降(加速度2，减速度0)； 

（4）离心后，血液被分为4 层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第

2 层)、分离液(第3 层)和红细胞层(底层)构成。

3、制备PBMC

（1）用吸管将第2 层单个核细胞收集至新的离心管；

（2）加入40 ml PBS洗涤细胞悬液，300g 离心8 min；

（3）弃去上清液，再加入40 ml PBS洗涤细胞悬液，300g 离心8 min。

（4）弃去上清液，加入20 ml NK Cell Culture Medium稀释细胞悬液，混匀，取100 μl 悬液细胞计数，余下悬液300g 离心 8 min。

注：整套试剂可激活4-6*10⁷PBMC，多余细胞可以弃去。

4、NK 细胞扩增

(1)  Day0，配置NK细胞扩增液A：将全部的NK Cell Grower 2加入到25 ml NK Cell Culture Medium 中，同时加入2.5 ml灭活后的自体血浆。用该扩增液重悬将上述细胞到2~2.5*10⁶/ml(根据收获的PBMC细胞数来决定重悬密度, 确保重悬密度在该范围内, 有利于NK细胞激活)；

（2）在已包被的T75培养瓶中，加入以上细胞悬浮液(以20~25ml最合适)，请沿培养瓶侧壁加入细胞，动作需轻柔，请勿直接吹打培养瓶底；

(3）5% CO2、37℃培养3天(在此期间请勿移动细胞，整个培养以静置为主)；

(4)  Day3，配置NK细胞扩增液B：将全部的NK Cell Grower 3加入到460 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管轻轻吹打T75培养瓶中的细胞，将细胞悬液全部转入T175培养瓶内，加入40 ml NK细胞扩增液B(剩余扩增液B放2-8℃保存)，同时补加4 ml灭活后的自体血浆；

(5)  Day5，用移液管轻轻吹打细胞，取细胞进行计数，加入约80 ml NK细胞扩增液B于T175培养瓶内，同时补加4 ml灭活后的自体血浆，使细胞密度保持在1*10⁶/ml左右；

(6)  Day7，用移液管轻轻吹打细胞，将细胞悬液平均转入两个培养袋内，加入剩余的NK细胞扩增液B和剩余的灭活自体血浆（每个培养袋等量加入）；

(7)  Day9，配置NK细胞扩增液C：将全部的NK Cell Grower 4加入到剩余的1500 ml NK Cell Culture Medium 中。视细胞生长密度，每个培养袋补加350-450 ml NK细胞扩增液C（使补液后细胞密度保持在0.8*10⁶/ml左右）(剩余扩增液C放2-8℃保存)；

(8)  Day11，向每个培养袋内补加等量剩余的NK细胞扩增液C；

(9)  Day14，鉴定细胞，同时取样检测真菌、细菌、支原体、内毒素等指标。

所有培养液使用前需先预温，用多少预温多少, 避免反复预温对细胞因子活性的影响！

5、细胞收集

（1）经过14 天的培养，将细胞悬浮液从培养袋，转入大型的离心瓶，用离心机以600g 离心10 min，分离细胞和培养基；

（2）小心地移去上清液，用含有0.1%人类血清白蛋白的生理盐水(0.1%HSA 生理盐

水)，悬浮所有的细胞沉淀物，收集到一个离心瓶中。重复离心，清洗细胞3 次；

（3）收集细胞，用适量含有1%人类血清白蛋白的生理盐水重悬细胞，通过一次性

细胞筛(200目)过滤，收集并注入含有1%人类血清白蛋白的生理盐水回输液中，总量为100~200 ml。封装好后送病房，同时留样封存以备日后检测。

附录  操作流程表：