NK 细胞培养标准操作方案

(1L 体系版本)

为了能获得稳定可靠的结果，请严格按照以下所述步骤进行操作，并使用我们推荐的实验耗材及试剂。本试剂盒包含四种刺激组分(NK Cell Grower1~4)，每管体积为500 μl，建议每管组分拿出静置后再加入到培养基中，并用培养基润洗管子，以确保每管所有组分都能加入到培养基中。请认真阅读说明书配置每种扩增液！

【实验材料】

NK Cell Culture Medium(1000 ml)

NK Cell Grower 1(500 μl) NK Cell Grower 2(500 μl) NK Cell Grower 3(500 μl) NK Cell Grower 4(500 μl)

悬浮细胞专用细胞培养瓶(T25、T75、T175)(透气盖培养瓶，推荐康宁品牌) 悬浮细胞专用培养袋

淋巴细胞分离液

无菌生理盐水或PBS

【实验操作方案】

* 所有的工作必须在无菌室中进行，请严格遵守无菌操作规范，使用无菌耗材。

1、培养瓶包被

(1) 在T-25 cm2 悬浮培养瓶中，加入3.5 ml PBS 和500 μl NK Cell Grower 1；

(2) 轻轻摇晃，使溶液在培养瓶瓶底扩散，铺满瓶底；

(3) 37℃培养箱静置2 h 或在4℃静置过夜；

(4) 移除包被溶液，用 5 ml PBS 润洗瓶底 1 次(请勿吹打瓶底)，洗过的培养瓶要立即使用。

2、血液分离

（1） 采集 20 ml 外周血于抗凝管(务必用肝素抗凝管)，800g，15 min 室温离心；

（2） 自体血浆制备：取上清血浆，置于水浴锅中 56℃，灭活 30 min 后 1100g，15 min 室温离心，用移液管将上清转移至新的 15 ml 管内，4℃保存备用；

（3） 取上述离心后下部细胞成分，加 PBS 至 20 ml，混匀，加到 2 个装有 10 ml 医疗级人淋巴细胞分离液的 50 ml 离心管中，室温下， 500g 离心 30 min，慢升慢降(加速度 2，减速度 0)；

（4） 离心后，血液被分为 4 层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第 2

层)、分离液(第 3 层)和红细胞层(底层)构成。

3、制备PBMC

（1） 用吸管将第 2 层单个核细胞收集至新的离心管；

（2） 加入 40 ml PBS 洗涤细胞悬液，300g 离心 8 min；

（3） 弃去上清液，再加入 40 ml PBS 洗涤细胞悬液，300g 离心 8 min。

（4） 弃去上清液，加入 20 ml NK Cell Culture Medium 稀释细胞悬液，混匀，取 100 μl 悬液细胞计数，余下悬液 300g 离心 8 min。

注：整套试剂可激活2-2.5*107PBMC，多余细胞可以弃去。

4、NK 细胞扩增

(1) Day0，配置NK细胞扩增液A：将全部的NK Cell Grower 2(500 μl)加入到10 ml NK Cell Culture Medium 中，加入1 ml灭活后的自体血浆。用该扩增液重悬将上述细胞到2~2.5*106/ml(该套试剂盒中只能配置10 ml扩增液A，即重悬2~2.5*107 细胞，因此多余细胞在上述计数后可以弃去)；

（2） 在已包被的T25培养瓶中，加入以上细胞悬浮液(以8 ml最合适，即起始细胞总数为1.6~2*107)，请沿培养瓶侧壁加入细胞，动作需轻柔，请勿直接吹打培养瓶底；

(3）5% CO2、37℃培养3 天(在此期间请勿移动细胞，整个培养以静置为主)；

(4) Day3，配置NK细胞扩增液B：将全部的NK Cell Grower 3(500 μl)加入到130 ml NK Cell Culture Medium 中。用移液管轻轻吹打T25培养瓶中的细胞，将细胞悬液全部转入T75培养瓶内，加入15 ml NK细胞扩增液B(剩余扩增液B放2-8℃保存)， 同时补加1.5 ml灭活后的自体血浆；